由于光学衍射极限(Abbe diffraction limit)的限制，传统的远场光学显微镜不能够提供小于其观察波长一半尺寸(通常为200-300 nm)的结构信息。为了突破这一物理极限，实现纳米级甚至分子级别的成像分辨率，近年来逐渐发展了超分辨成像技术。借助于特异性的超分辨荧光探针,这项技术可以标记（单色）和区分（多色）蛋白等生物大分子,并在高分辨率尺度下揭示活细胞内活性分子的动态生理过程，现已成为观测细胞或组织超微结构和揭示细胞内物质相互作用的重要方法。

但是，该技术的应用与发展一直受限于荧光染料的亮度和稳定性。相比于传统光学成像，超分辨荧光成像建立在更大规模的光子统计数据的基础上。为了进一步提升成像分辨率、改善成像质量，人们希望设计出具有更高亮度以及更好光稳定性的荧光染料。

图1季铵化哌嗪罗丹明-提升亮度的新型超分辨荧光染料

近期，大连理工大学精细化工国家重点实验室肖义教授课题组与合作者新加坡科技设计大学的刘晓刚教授课题组发展了一种季铵化哌嗪的新策略。如图1所示，该策略通过将具有吸电子效应的季铵基团连接在供体芳香胺上，降低了胺基的整体供电子能力，使得罗丹明染料的激发态扭转(TICT)态更不稳定，从而有效抑制TICT态的形成。实验表明，季铵化哌嗪罗丹明分子具有更好的单分子亮度及更多的总收集光子数，表现出更强的单分子定位超分辨成像潜力。作者运用标记有季铵化哌嗪罗丹明的抗体进行了微管标记的超分辨成像(图1右)，展示了季铵化哌嗪罗丹明在定位型成像中可以提供更高的定位密度和更好的定位型超分辨成像的能力。

为了在活细胞水平上验证季铵化哌嗪罗丹明染料的成像优势，作者开发了两种针对亚细胞器标记的探针，即细胞膜探针(Mem-R)和溶酶体探针(Lyso-R)。两种染料在成像条件下，均在活细胞靶标位置展现出闪烁的单分子信号特征。基于这些闪烁的单分子信号，成功地对活细胞的细胞膜和溶酶体进行了定位型超分辨成像（图2）。最后，为了更进一步地说明季铵化哌嗪策略的可拓展性，还开发了萘酰亚胺和NBD染料的衍生物。这些结果证实了季铵化哌嗪策略改善推拉结构染料的通用性，并为未来开发具有高亮度的、可适用于超分辨成像的荧光染料提供了很好的指导。

图2 季铵化哌嗪罗丹明探针用于细胞膜和溶酶体的定位型超分辨成像

相关研究成果发表在J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 14491上，大连理工大学博士研究生叶智伟，大连理工大学精细化工国家重点实验室工程师杨薇，新加坡科技设计大学王超博士和大连理工大学博士研究生郑莹为文章的共同第一作者。该工作得到了国家自然科学基金和大连理工大学的大力支持。

大连理工大学精细化工国家重点实验室肖义教授课题组一直致力于通过分子设计提升荧光染料的超分辨成像能力。将罗丹明染料衍生具有DNA双链大分子靶向功能的Hoechst标记基团，成功完成了对活细胞的细胞核DNA的定位型超分辨成像(Chem. Commun., 2018, 54, 2842)。近期，该课题组还发展了一种将羧基引入罗丹明螺环结构的分子设计策略，提升了罗丹明螺内酰亚胺染料的亮态寿命，并成功实现了对线粒体、细胞核组蛋白以及微管结构的光激活超分辨成像(J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 6527)。